ELEKTROFOREZA SDS-PAGE PDF

Het medium ook wel "matrix" is een polyacrylamide-gel gebaseerde discontinu. Bovendien, SDS natriumdodecylsulfaat wordt gebruikt. SDS fungeert als een oppervlakteactieve stof , die intrinsieke lading van de eiwitten en verlenen ze zeer vergelijkbaar lading tot massaverhoudingen. De intrinsieke kosten van de eiwitten zijn verwaarloosbaar in vergelijking met de SDS laden en de positieve ladingen worden ook sterk verminderd in het basische pH-gebied van een scheidende gel. Bij het aanleggen van een constant elektrisch veld, het eiwit migreren naar de anode, elk met een andere snelheid, afhankelijk van de massa. Deze eenvoudige procedure maakt nauwkeurige eiwitscheidingstechnieken massa.

Author:Malazilkree Barisar
Country:Timor Leste
Language:English (Spanish)
Genre:Life
Published (Last):20 January 2013
Pages:34
PDF File Size:4.98 Mb
ePub File Size:10.94 Mb
ISBN:487-8-89180-566-9
Downloads:23139
Price:Free* [*Free Regsitration Required]
Uploader:Vudokazahn



Het medium ook wel "matrix" is een polyacrylamide-gel gebaseerde discontinu. Bovendien, SDS natriumdodecylsulfaat wordt gebruikt. SDS fungeert als een oppervlakteactieve stof , die intrinsieke lading van de eiwitten en verlenen ze zeer vergelijkbaar lading tot massaverhoudingen. De intrinsieke kosten van de eiwitten zijn verwaarloosbaar in vergelijking met de SDS laden en de positieve ladingen worden ook sterk verminderd in het basische pH-gebied van een scheidende gel.

Bij het aanleggen van een constant elektrisch veld, het eiwit migreren naar de anode, elk met een andere snelheid, afhankelijk van de massa. Deze eenvoudige procedure maakt nauwkeurige eiwitscheidingstechnieken massa. SDS neigt bolvorm micellen in waterige oplossingen boven een bepaalde concentratie genaamd de kritische micelconcentratie CMC.

Boven de kritische micellaire concentratie van mM in oplossing, het SDS gelijktijdig plaatsvindt als afzonderlijke moleculen monomeer en micellen, onder de CMC SDS treedt alleen monomeren in waterige oplossingen. Op de kritische micelconcentratie, een micel bestaat uit ongeveer 62 SDS moleculen.

Slechts SDS monomeren binden aan eiwitten via hydrofobe wisselwerkingen, terwijl de SDS micellen anionogene aan de buitenkant en wel geen eiwitten adsorberen. SDS is amfipatisch karakter, die het mogelijk maakt om zowel polaire als apolaire delen van eiwitstructuur ontvouwen. In SDS-concentraties boven 0,1 millimolair, het ontvouwen van eiwitten begint en boven 1 mM meeste eiwitten worden gedenatureerd.

Vanwege de sterke denaturerende effect van SDS en de daaropvolgende dissociatie van eiwitcomplexen, quaternaire structuren kan meestal niet worden bepaald met SDS. Denatureren de SDS-resistente complexen een hoge activeringsenergie nodig, die wordt verkregen door verhitting. SDS weerstand is gebaseerd op een metastabiliteit van het eiwit vouwen.

Hoewel de natieve volledig gevouwen SDS-resistente eiwitten voldoende stabiliteit in aanwezigheid van SDS heeft, het chemisch evenwicht van denaturatie bij kamertemperatuur gebeurt traag.

Stabiele eiwitcomplexen worden niet alleen gekenmerkt door SDS weerstand maar ook door de stabiliteit tegen proteasen en een verhoogde biologische halfwaardetijd. Procedure SDS-PAGE-werkwijze bestaat uit gelbereiding, monstervoorbereiding, elektroforese, eiwitkleuring of Western blotting en analyse van de gegenereerde bandpatroon.

De gel wordt bereid door radicaalpolymerisatie in een mal bestaande uit twee afgedichte glazen platen met afstandhouders tussen de glasplaten. In een typische mini-gel instelling, de afstandhouders een dikte van 0,75 mm of 1,5 mm, dat het laadvermogen van de gel bepaald. Voor het gieten van de geloplossing worden de platen gewoonlijk ingeklemd in een stand die tijdelijk dicht de overigens open onderzijde van de glasplaten met de twee afstandhouders.

De oplossing wordt vervolgens tussen glasplaten gegoten zonder dat luchtbellen. Afhankelijk van de hoeveelheid katalysator en radicale starter en afhankelijk van de temperatuur, de polymerisatie duurt tussen een kwart van een uur en enkele uren. De onderste gel scheidingsgel eerst gegoten en bedekt met enkele druppels van een nauwelijks in water oplosbare alcohol meestal buffer-verzadigde butanol of isopropanol , die luchtbellen elimineert de meniscus en beschermt de geloplossing van de radicaalvanger zuurstof.

Na de polymerisatie van de scheidende gel, wordt de alcohol verwijderd en de overblijvende alcohol wordt verwijderd met filtreerpapier. Daarna wordt een geschikt monster kam ingestoken tussen de glasplaten zonder dat luchtbellen. Het monster kam wordt voorzichtig uitgetrokken na polymerisatie, waardoor zakken voor de voorbeeldtoepassing.

Commercieel gelsystemen zogenaamde pre-cast gels meestal de bufferstof bis-tris methaan met een pH tussen 6,4 en 7,2 in zowel de stacking gel en de scheidende gel. Deze gels worden geleverd cast en kant-en-klare. Hoe meer neutrale pH vertraagt de hydrolyse en daarmee de afbraak van het polyacrylamide.

Door de constante pH in het verzamelen en scheidingsgel er geen stapeleffect. Eiwitten BisTris gels kunnen niet worden gekleurd met rutheniumcomplexen. Verwarmen verstoort de secundaire en tertiaire structuur van het eiwit door het verstoren waterstofbindingen en strekken van de moleculen.

Eventueel disulfidebruggen kan worden gesplitst door reductie. Na afkoelen tot kamertemperatuur, wordt elk monster gepipetteerd in een eigen goed in de gel, die voorheen elektroforesebuffer werd ondergedompeld in de electroforese-inrichting. Naast de monsters, een molecuulgewicht groottemarker wordt gewoonlijk geladen op de gel. De grootte marker wordt vaak gepipetteerd in de eerste of de laatste zak van een gel. In de eerste zak werd een afmeting markering aangebracht met broomfenolblauw, in de andere vakken werden de monsters toegevoegd broomcresolgroen Voor scheiding worden de gedenatureerde monsters geladen op een gel van polyacrylamide, ondergebracht in een elektroforese buffer met geschikte elektrolyten.

Daarna wordt een spanning gewoonlijk ongeveer V, V per cm lengte gel wordt aangebracht, die een migratie van negatief geladen moleculen veroorzaakt door de gel in de richting van de positief geladen anode. De gel werkt als een zeef. Kleine eiwitten migreren relatief gemakkelijk door de mazen van de gel, terwijl de grotere eiwitten eerder worden vastgehouden en daardoor langzamer migreren door het gel, waardoor eiwitten worden gescheiden door molecuulgrootte.

De elektroforese duurt tussen een half uur tot enkele uren afhankelijk van de spanning en de lengte van gel gebruikt. De snelst migrerende eiwitten met een molecuulgewicht van minder dan 5 kDa vormen de buffer voor samen met de anionische bestanddelen van de elektroforese buffer, die eveneens door de gel migreren.

Het gebied van de buffer diepte wordt zichtbaar gemaakt door toevoeging van de relatief kleine, anionische kleurstof broomfenolblauw de monsterbuffer. Als gevolg van de relatief kleine molecule grootte van broomfenolblauw, migreert sneller dan eiwitten.

Door optische controle van de migrerende gekleurde band, kan de elektroforese gestopt voordat de kleurstof en ook monsters volledig gemigreerd door de gel en laat het. De meest gebruikte elektrolyt is een SDS-bevattende Tris - glycine - chloride buffer systeem. Bij neutrale pH, glycine vormt voornamelijk de zwitterionische vorm, bij hoge pH de glycines verliezen positieve ladingen en wordt hoofdzakelijk anionogeen.

Voor de scheiding van kleinere eiwitten en peptiden, tris- Tricine is buffersysteem van Schagger en Von Jagow gebruikt vanwege de grotere spreiding van de eiwitten in het traject van 0,5 tot 50 KDa. In de linker laan, werd een moleculair gewicht groottekenmerk gebruikt om de grootte van boven naar beneden: 66, 45, 35, 24, 18 en 9 kDa te schatten. In de overige lanen werden gezuiverd gisteiwitten gescheiden. Aan het einde van de elektroforetische scheiding worden alle eiwitten gesorteerd op grootte en kan vervolgens worden geanalyseerd door andere methoden, zoals eiwitkleuring zoals Coomassie kleuring meest voorkomende en makkelijk te gebruiken , zilverkleuring hoogste gevoeligheid , allemaal vlekken kleuring amido zwart 10B kleuring, Fast green FCF vlekken, fluorescerende vlekken zoals epicocconone vlek en SYPRO oranje vlek, en immunologische detectie, zoals de Western Blot.

De fluorescerende kleurstoffen hebben een relatief hogere lineariteit tussen eiwithoeveelheid en kleurintensiteit van ongeveer drie ordes van grootte hoger dan de detectielimiet , dwz de hoeveelheid eiwit kan worden geschat door kleurintensiteit. Bij gebruik van de fluorescente kleurstof eiwit trichloorethanol , wordt een volgende eiwitkleuring weggelaten indien de geloplossing werd toegevoegd en de gel werd bestraald met UV-licht na elektroforese.

Membraaneiwitten , vanwege hun transmembraandomein , zijn vaak samengesteld uit het meer hydrofobe aminozuren, hebben een lagere oplosbaarheid in waterige oplossingen, de neiging te binden lipiden en vaak precipiteren in waterige oplossingen vanwege hydrofobe effecten wanneer voldoende hoeveelheden detergens niet aanwezig. In dit geval kan meer SDS worden gebruikt met min of meer geconcentreerde monsterbuffer en de hoeveelheid eiwit in de voorbeeldtoepassing worden verminderd.

Een overbelasting van de gel met een oplosbaar eiwit leidt tot een halfcirkelvormige band van dit eiwit bijvoorbeeld in het merkerlaantje van het beeld bij 66 KDa , zodat andere eiwitten met gelijke molecuulgewichten te bedekken. De documentatie van het bandpatroon wordt meestal gedaan door fotograferen of scannen. Voor een daaropvolgende terugwinning van de moleculen in afzonderlijke banden, een gel extractie kan worden uitgevoerd. Archiveren Twee SDS-gels na voltooide scheiding van de monsters en kleuring in een droogrek Na eiwitkleuring en documentatie van het bandpatroon, kan de polyacrylamide gel gedroogd archivering.

Eiwitten kunnen worden gewonnen uit het op een later tijdstip. Vervolgens een tweede natte cellofaan film wordt aangebracht zonder bellen, wordt het tweede framedeel bovenop en het frame wordt afgesloten met klemmen.

De verwijdering van de luchtbellen vermijdt fragmentatie van de gel tijdens het drogen. Het water verdampt door de cellofaan film. Molecuulmassa bepalen De eiwitten van de grootte marker X zwart vertonen een bij benadering rechte lijn in de representatie van log M RV. Het molecuulgewicht van het onbekende eiwit rode X kan worden bepaald op de y-as.

Voor een nauwkeurige bepaling van het molecuulgewicht, worden de relatieve migratie afstanden van de afzonderlijke eiwitbanden gemeten in de scheidende gel. De metingen worden meestal uitgevoerd in drievoud voor verhoogde nauwkeurigheid.

De afstanden van de banden en de buffer voor elk gemeten vanaf het begin van de gel. De afstand van de buffer voor ruwweg overeenkomt met de afstand van de broomfenolblauw in de monsterbuffer. De relatieve afstanden van de eiwitten van de groottemerker uitgezet semi-logaritmische tegen hun bekende molecuulgewichten. Ten opzichte van het lineaire gedeelte van de grafiek gegenereerd of een regressieanalyse kan het molecuulgewicht van een onbekend eiwit wordt bepaald door de relatieve mobiliteit.

Bands van eiwitten met glycosyleringen kan worden wazig. Eiwitten met verschillende basische aminozuren zoals histonen kunnen leiden tot een overschatting van het molecuulgewicht of zelfs niet migreert in de gel helemaal omdat ze langzamer de elektroforese verplaatst door de positieve ladingen of zelfs tegengestelde richting.

Dienovereenkomstig kan vele zure aminozuren leiden tot versnelde migratie van een eiwit en een onderschatting van de moleculaire massa. Het heeft relatief lage instrument en reactieve kosten en een gemakkelijk te gebruiken methode.

Vanwege de lage schaalbaarheid , is het meestal gebruikt voor analysedoeleinden en minder voor preparatieve doeleinden, in het bijzonder wanneer grotere hoeveelheden van een eiwit te isoleren.

Post-translationele modificaties van eiwitten kan leiden tot een verschillende relatieve beweeglijkheid een bandverschuiving of een wijziging van de binding van een detectie-antilichaam dat in deze western blot een band verdwijnt of lijkt. Inheemse PAGE wordt gebruikt wanneer inheemse eiwitvouwing gehandhaafd moet worden. Voor elektroforetische scheiding van grote eiwitcomplexen, agarose gel elektroforese kunnen worden gebruikt, bijvoorbeeld de SDD-AGE. Sommige enzymen kunnen worden gedetecteerd via de enzymactiviteit van zymografie.

Wanneer niet-denaturerende omstandigheden noodzakelijk worden eiwitten gescheiden door een natief PAGE of andere chromatografische werkwijzen latere fotometrische kwantificering bijvoorbeeld affiniteitschromatografie of tandem affiniteitszuivering , grootte-uitsluitingschromatografie , ionenuitwisselingschromatografie. Eiwitten kunnen ook worden gescheiden op grootte in een tangentiale stroming filtratie of ultrafiltratie. Sommige methoden historisch vroegtijdige en rendabele maar ruwe scheiding gewoonlijk gebaseerd op een reeks extracties en precipitaties gebruik kosmotropic moleculen, bijvoorbeeld ammoniumsulfaatprecipitatie en polyethyleenglycol precipitatie.

Geschiedenis In , Arne Tiselius kreeg de Nobelprijs voor chemie voor de ontdekking van het beginsel van elektroforese zoals de migratie van geladen en opgeloste atomen of moleculen in een elektrisch veld.

De toepassing van een vaste matrix initieel papierschijven in een streekelektroforese verbeterde scheiding. De discontinue elektroforese van L. Ornstein BJ Davis maakte het mogelijk om de scheiding door het stapeleffect verbeteren. Het denaturerende effect van SDS continu polyacrylamidegels en de daaruit voortvloeiende betere resolutie voor het eerst beschreven in door David F.

Summers in de werkgroep van James E. Darnell aan poliovirus eiwitten te scheiden. Laemmli en aanvankelijk gebruikt om de eiwitten te karakteriseren in de kop van bacteriofaag T4.

LOOKING AT MOVIES BARSAM 3RD EDITION PDF

Electrophoresis and Blotting

Zie ook: elektroforese Overzicht van gelelektroforese. In eenvoudige termen, elektroforese is een werkwijze die de sortering van moleculen op basis van grootte mogelijk. Behulp van een elektrisch veld, kunnen moleculen bijvoorbeeld DNA worden aangebracht om door een gel van agarose of polyacrylamide. Het elektrische veld bestaat uit een negatieve lading aan het ene uiteinde waarvan de moleculen door de gel duwt, en een positieve lading aan de andere kant dat de moleculen trekt door de gel. De moleculen worden gesorteerd worden gebracht in een put in het gelmateriaal. De gel wordt in een elektroforesekamer, die vervolgens wordt verbonden met een energiebron. Wanneer de elektrische stroom wordt toegepast, het grotere moleculen bewegen langzamer door de gel, terwijl de kleinere moleculen sneller bewegen.

EDWARD STACHURA WIERSZE PDF

Polyacrylamide gel electrophoresis

De eiwitmengsels zijn hier gekleurd met broomcresolgroen. De meest linkse is een moleculaire ladder. SDS-PAGE Engelse afkorting voor sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, oftewel natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese is een elektroforesetechniek die in de biochemie wordt toegepast om eiwitten te scheiden op basis van grootte molecuulgewicht. Er wordt aan een te scheiden monster natriumdodecylsulfaat SDS toegevoegd. Dit wordt op een polyacrylamidegel aangebracht en vervolgens wordt er door middel van spanning gescheiden. Gedurende de scheiding zullen de geladen moleculen zich over de gel bewegen, waarbij de klein fragmenten zich sneller door de gel zullen verplaatsen dan de grote.

EMOCINIS INTELEKTAS KNYGA PDF

Sample preparation[ edit ] Samples may be any material containing proteins or nucleic acids. These may be biologically derived, for example from prokaryotic or eukaryotic cells, tissues, viruses, environmental samples, or purified proteins. In the case of solid tissues or cells, these are often first broken down mechanically using a blender for larger sample volumes , using a homogenizer smaller volumes , by sonicator or by using cycling of high pressure, and a combination of biochemical and mechanical techniques — including various types of filtration and centrifugation — may be used to separate different cell compartments and organelles prior to electrophoresis. Synthetic biomolecules such as oligonucleotides may also be used as analytes. Reduction of a typical disulfide bond by DTT via two sequential thiol-disulfide exchange reactions.

Related Articles